Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP)

A estructura da cromatina desenrola un papel fundamental na función do DNA. Regula procesos que se dan sobre a estructura nucleosomal como a transcripción, a replicación e a recombinación. Polo tanto, determina-la distribución das modificacións específicas das histonas e as súas variantes así como a doutros compoñentes da cromatina sobre secuencias específicas do DNA pode proporcionar información importante acerca de como funcionan estas proteínas (e as súas modificacións) dentro do contexto da cromatina.
A Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP) é un método bioquímico empregado principalmente para determina-la localización no xenoma das histonas modificadas e doutras proteínas in vivo. Esta técnica consiste no uso dun anticorpo que recoñeza a proteína de interese non soamente en disolución senon tamén na cromatina.
A ChIP consta basicamente de dous pasos, entrecruzamento con formaldehido do DNA coas proteínas unidas a este en células en cultivo para que se fixen as interaccións proteína-proteína e as interaccións proteína-DNA seguido da inmunoprecipitación dos complexos proteína-DNA con anticorpos específicos a partir de extractos sonicados para fragmentar a cromatina. As secuencias específicas do DNA inmunoprecipitadas son entón amplificadas por PCR para determinar se foron ou non enriquecidas nas mostras correspondentes a cada anticorpo (Kuo e Allis,1999).

Referencias:
Kuo MH, Allis CD.
In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.
Methods. 1999 Nov;19(3):425-33.

Análise da metilación de illas CpG mediante PCR específica de metilación (MSP) e secuenciación de bisulfito

Actualmente existe unha grande variedade de métodos diseñados para proporcionar información cuantitativa e cualitativa sobre o estado de metilación do DNA xenómico. As primeiras aproximacións centrábanse no estudio de niveis globais de metil-citosina, máis recentemente os esforzos enfócanse cara o estudio do estado de metilación de secuencias específicas do DNA. Concretamente, a optimización dos métodos basados no tratamento do DNA con Bisulfito sódico (Clark et al. 1994) permite a análise dun número limitado de CpGs basándose no seu estado de metilación(v.g. PCR específica de metilación, MSP) así como a caracterización de patrones moi específicos de metilación (secuenciación de DNA modificado con Bisulfito sódico).
O bisulfito sódico convirte as citosinas non metiladas en uracilos mentres as metiladas permanecen como tales. Esta reacción permite diferenciar o DNA metilado do DNA non metilado. A metilación do DNA producida polo tratamento con Bisulfito sódico pódese estudiar mediante varios métodos, entre os que se atopan a secuenciación, a MSP, as análises de restricción, etc.

A PCR específica de metilación (MSP) é a técnica máis empregada para estudiar a metilación de illas CpG, moi comúns nos promotores de moitos xenes. As citosinas das illas CpG atópanse normalmente desmetiladas nos tecidos normais pero metílanse en promotores de xenes implicados en procesos celulares anormais coma o cancro (esteller at al. 2001). A PCR específica de metilación (Herman et al. 1996) é unha das técnicas máis eficientes para estudia-los perfís de metilación destas rexións. As diferencias obtidas entre alelos metilados e non metilados ó tratar con bisulfito sódico o DNA son a base da PCR específica de metilación e son especialmente útiles para o estudio de illas CpG pola abundancia de sitios CpG que conteñen.
O deseño de primers é un dos pasos máis complexos e críticos da MSP. As hebras de DNA modificadas con bisulfito sódico deixan de ser complementarias polo que deben deseñarse primers específicos para cada unha. A gran sensibilidade desta técnica permite determina-lo estado de metilación de mostras pequenas de DNA, incluindo mostras provintes de tecidos embebidos en parafina ou microdeseccionados (Herman et al. 1996). Non obstante, determina-la metilación a nivel de nucleótido require a secuenciación dos productos de PCR; a obtención de datos cuantitativos e a identificación de heteroxeneidade celular en poboacións aínda non é posible con esta técnica.
A versatilidade da PCR específica de metilación permite que sexa empregada coma unha ferramenta clínica rápida para a evaluación inicial nunha grande cantidade de pacientes con enfermidades dependentes de alelo. Por exemplo, a PCR específica de metilación emprégase na actualidade para evalua-lo estado de metilación da illa CpG do xen SNRPN e polo tanto para realizar unha diagnose rápida dos síndromes de Prader-Willi e Angelman (Kosaki et al. 1997).

Referencias:
Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M.
High sensitivity mapping of methylated cytosines.
Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.

Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG.
A gene hypermethylation profile of human cancer.
Cancer Res. 2001 Apr 15;61(8):3225-9.

Furuichi Y, Wataya Y, Hayatsu H, Ukita T.
Chemical modification of tRNA-Tyr-yeast with bisulfite. A new method to modify isopentenyladenosine residue.
Biochem Biophys Res Commun. 1970 Dec 9;41(5):1185-91.

Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB.
Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6.

Kosaki K, McGinniss MJ, Veraksa AN, McGinnis WJ, Jones KL.
Prader-Willi and Angelman syndromes: diagnosis with a bisulfite-treated methylation-specific PCR method.
Am J Med Genet. 1997 Dec 19;73(3):308-13.

Electroforesis Capilar de Alta Resolución (HPCE)

Metilación Global do DNA

A metilación global do DNA considérase un marcador molecular de diversos procesos biolóxicos como o cancro (Esteller et al. 2001, Piyathilake et al. 2001) e o desenrolo ontoxénico tanto en plantas (Fraga et al. 2000a) como animais (Jones e Wolffe, 1999). Na actualidade, a concentración de metil-citosinas no DNA xenómico cuantifícase mediante separacións de alta resolución (HPCE e HPLC) ou mediante o uso de estratexias enzimáticas e químicas. O desenrolo de tácnicas de Electroforesis Capilar (CE) presenta varias ventaxes sobre os métodos empregados ata ese momento para cuantificar o grado de metilación do DNA. Dende que se desenroló a CE tense comprobado que ten unha grande capacidade para separar diversos compoñentes do DNA, incluíndo toda unha serie de aductos das bases (Norwood et al. 1993), Fraga et al. (Fraga et al. 2000b) publicou a cuantificación relativa de metil-citosinas no DNA xenómico de plantas empregando un sistema de Electroforesis Capilar de Alta Resolución (HPCE) para analizar DNA xenómico hidrolizado con ácido. Neste contexto a separación e cuantificación de citosina e metil-citosina só é posible co uso dun sistema micelar de SDS.

No noso laboratorio emprégase unha nova estratexia para determina-la cantidade relativa de metilación do DNA xenómico mediante a cuantificación de 2´-desoxi-nucleósidos. A detección e cuantificación de 5-metil 2´-desoxi-citidina no DNA xenómico realízase empregando unha electrforesis capilar micelar de alta resolución (HPCE) e UV-vis como detector. Viuse que esta estratexia é máis sensible e específica que outros métodos de HPCE para determina-la cantidade de metilación no DNA, ademáis de ser máis rápida e barata que outros métodos basados en el HPLC. A hidrólisis enzimática de nucleósidos mellora considerablemente a súa detección e cuantificación e permite o uso desta técnica na análise de mostras de DNA sucias ou pouco concentradas coma adoitan ser as obtidas a partires das rexións meristemáticas de plantas ou tecidos embebidosen parafina (Fraga et al. 2002). A liberación química de bases do DNA imprica a producción dunha mezcla complexa de moléculas que comprica a detección e cuantificación de metil-citosina cando o DNA non está purificado e/ou concentrado dabondo. Este problema pódese solventar hidrolizando o DNA con Nucleasa P1 e fosfatasa alcalina para producir 2´-desoximononucleósidos, que son separados modificando o método de HPCE descrito previamente. Non obstante, debido ó baixo volume de mostra que se inxecta, as análises preparativos con HPCE non son posibles.

Interaccións DNA-Proteína

As interaccións DNA-proteínas son un factor crítico nunha ampla variedade de estudios biolóxicos, especialmente naqueles relacionados coa estructura da cromatina e a regulación da función xénica. Existen diversas técnicas empregadas habitualmente para o estudio de interaccións DNA-proteínas entre as que compre destaca-los ensaios de variación de movilidade electroforética (EMSA) (Ceglarek e Revzin, 1989). Aínda que o EMSA mostrouse moi útil en diferentes estudios de interacción DNA-proteína, o seu uso non serve para a análise cuantitativo destas interaccións e a obtención de constantes de afinidade por este método é unha tarea moi tediosa. Pola contra, o cálculo das afinidades DNA-proteína pódese facer de maneira precisa co uso de técnicas calorimétricas (Nakatani et al. 2001) pero o equipo necesario non se atopa habitualmente en laboratorios de bioquímica e bioloxía molecular. Non obstante, o uso da Electroforesis Capilar de Alta Resolución (HPCE) permite o desenrolo de métodos precisos e reproducibles para cuantificar a afinidade DNA-proteína baseados na súa capacidade para separar complexos macromoleculares das subunidades coas que interacciona a alta resolución. De feito, véñense a realizar numerosos estudios de interaccións ligando-DNA por HPCE con capilares de sílice fundida non tratados (Tanaka e Terabe, 2002), pero polo xeral, as proteínas de unión a DNA son ricas en aminoácidos básicos e isto provoca a súa adsorción á superficie dos capilares. Así, a adsorción de proteínas con grupos cargados ás paredes do capilar que contén sitios con cargas negativas é o maior contratempo dos métodos descritos previamente.
Para o estudio cuantitativo de interaccións DNA-proteína desenrolouse un rápido e sinxelo ensaio de variación da movilidade electroforética capilar (CEMSA) con fluorescencia inducida por láser (LIF) (Fraga et al. 2003). Este método é útil sobretodo para o estudio de proteínas básicas, as máis comúns das proteínas que interaccionan co DNA. Para evitar que as proteínas se adhieran ás paredes do capilar, no laboratorio empregamos poloacrilamida neutra, que require o uso de polaridade reversa. Nestas condicións obtense unha separación excelente do DNA e os complexos DNA-proteína sen necesidade dunha matriz, o que permite á súa vez unha sinxela e eficaz cuantificación das afinidades DNA-proteína.

Cuantificación de modificacións postraduccionais de Histonas

A acetilación das histonas prodúcese polo efecto contraposto de dúas actividades enzimáticas, as actividades Histona Acetiltransferasa (HAT) e Histona Desacetilasa (HDAC) e son estas modificacións, xunto con outros cambios na cromatina, as que permiten as transicións dinámicas da cromatina e o cambio de estados de actividade transcripcional (Jenuwein e Allis, 2001). Por outra banda, a metilación das colas N-terminais das histonas H3 e H4 semella ser un proceso máis estáticoa diferencia da acetilación, que é un proceso moi dinámico. Polo tanto, a metilación é considerada unha marca epixenética máis que unha señal reguladora (Jenuwein, 2001). A metilación de histonas relaciónase sobre todo coa represión transcripcional a longo prazo da heterocromatina pero a diferencia do efecto que ten a acetilación global, o efecto que ten a metilación das histonas sobre a transcripcióndepende de cal é o residuo madoficado e do grado de metilación (Lachner e Jenuwein, 2002).
A cuantificación dos grados de acetilación das histonas H3 e H4 pódese realizar mediante unha modificación do método descrito por Lindner et al. (Lindner et al. 1992),onde as formas non acetiladas, mono, di, tri e tetraacetiladas das fraccións correspondentes á histona H3 y á H4pódense resolver mediante unha electroforesis capilar de alta resolución (HPCE). En concreto cun capilar de silice fundida non recuberto e empregando como tampón de separación unha disolución de fosfato con hidroxi-propil-metil-celulosa (HPM-celulosa) para eliminar as interaccións das proteínas extremadamente básicas cos parede do capilar.
Con esta técnica tamén é posible resolver a metilación asociada a cada especie acetilada para a histona h4, polo que se obtén un desdoblamento dos picos corresondentes a cada grado de acetilación, como se pode observar na figura.

Referencias:
Ceglarek JA, Revzin A.
Studies of DNA-protein interactions by gel electrophoresis.
Electrophoresis. 1989 May-Jun;10(5-6):360-5.

Esteller M, Fraga MF, Guo M, Garcia-Foncillas J, Hedenfalk I, Godwin AK, Trojan J, Vaurs-Barriere C, Bignon YJ, Ramus S, Benitez J, Caldes T, Akiyama Y, Yuasa Y, Launonen V, Canal MJ, Rodriguez R, Capella G, Peinado MA, Borg A, Aaltonen LA, Ponder BA, Baylin SB, Herman JG.
DNA methylation patterns in hereditary human cancers mimic sporadic tumorigenesis.
Hum Mol Genet. 2001 Dec 15;10(26):3001-7.

Fraga MF, Centeno ML, Valdes AE, Moncalean P, Canal MJ, Rodriguez R.
Genomic DNA methylation and polyamines levels as key processes in plant aging: applications for clonal multiplication of mature Pinus radiata trees, p. 495-506. In E. Ritter and S. Espinel (Eds.), Applications of Biotechnology to Forest Genetics. A.F. Albundia, Vitoria. 2000. (a)

Fraga MF, Rodriguez R, Canal MJ.
Rapid quantification of DNA methylation by high performance capillary electrophoresis.
Electrophoresis. 2000 Aug;21(14):2990-4. (b)

Fraga MF, Uriol E, Borja Diego L, Berdasco M, Esteller M, Canal MJ, Rodriguez R.
High-performance capillary electrophoretic method for the quantification of 5-methyl 2'-deoxycytidine in genomic DNA: application to plant, animal and human cancer tissues.
Electrophoresis. 2002 Jun;23(11):1677-81.

Fraga MF, Ballestar E, Esteller M.
Capillary electrophoresis-based method to quantitate DNA-protein interactions.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003 Jun 15;789(2):431-5.

Jenuwein T.
Re-SET-ting heterochromatin by histone methyltransferases.
Trends Cell Biol. 2001 Jun;11(6):266-73.

Jenuwein T, Allis CD.
Translating the histone code.
Science. 2001 Aug 10;293(5532):1074-80.

Jones PL, Wolffe AP.
Relationships between chromatin organization and DNA methylation in determining gene expression.
Semin Cancer Biol. 1999 Oct;9(5):339-47.

Lachner M, Jenuwein T.
The many faces of histone lysine methylation.
Curr Opin Cell Biol. 2002 Jun;14(3):286-98.

Lindner H, Helliger W, Dirschlmayer A, Jaquemar M, Puschendorf B.
High-performance capillary electrophoresis of core histones and their acetylated modified derivatives. Biochem J. 1992 283 (Pt 2) 467-71.

Nakatani K, Sando S, Kumasawa H, Kikuchi J, Saito I.
Recognition of guanine-guanine mismatches by the dimeric form of 2-amino-1,8-naphthyridine.
J Am Chem Soc. 2001 Dec 19;123(50):12650-7.

Norwood CB, Jackim E, Cheer S.
DNA adduct research with capillary electrophoresis.
Anal Biochem. 1993 Sep;213(2):194-9.

Piyathilake CJ, Frost AR, Bell WC, Oelschlager D, Weiss H, Johanning GL, Niveleau A, Heimburger DC, Grizzle WE.
Altered global methylation of DNA: an epigenetic difference in susceptibility for lung cancer is associated with its progression.
Hum Pathol. 2001 Aug;32(8):856-62.

Tanaka Y, Terabe S.
Estimation of binding constants by capillary electrophoresis.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002 Feb 25;768(1):81-92.

AIMS

Pronto na web!!

RLGS

Pronto na web!!