Immunoprecipitació de Cromatina (ChIP)

L'estructura de la cromatina exerceix un paper fonamental en la funció del DNA. Regula processos que es donen sobre l'estructura nucleosomal com la transcripció, la replicació i la recombinació. Per tant, determinar la distribució de les modificacions específiques de les histones i les seues variants, així com la d'altres components de la cromatina sobre en seqüències específiques del DNA pot proporcionar informació valuosa sobre com funcionen estes proteïnes (i les seues modificacions) dins del context de la cromatina.
La Immunoprecipitació de Cromatina (ChIP) és un mètode bioquímic usat principalment per a determinar la localització en el genoma d'histones modificades i d'altres proteïnes in vivo. Esta tècnica consistix en l'ús d'un anticòs que reconega la proteïna d'interés no sols en dissolució sinó també en la cromatina.
La ChIP consta bàsicament de dos passos, entrecreuament amb formaldehid del DNA a les proteïnes unides a este in vivo en cèl·lules perquè es fixen les interaccions proteïna-proteïna i les interaccions proteïna-DNA seguit de la immunoprecipitació dels complexos proteïna-DNA amb anticossos específics a partir d'extractes sonicats per a fragmentar la cromatina. Les seqüències específiques de DNA immunoprecipitades són llavors amplificades per PCR per a determinar si han sigut o no enriquides en les mostres corresponents per a cada anticòs (Kuo i Allis, 1999).

Referències:
Kuo MH, Allis CD.
In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.
Methods. 1999 Nov;19(3):425-33.

Anàlisi de la metilació d'illes CpG mitjançant PCR específica de metilació (MSP) i seqüenciació de bisulfit

Actualment hi ha una gran varietat de mètodes que proporcionen informació quantitativa i qualitativa sobre l'estat de metilació del DNA genòmic. Les primeres aproximacions se centraven en l'estudi de nivells globals de metil-citosina, més recentment els esforços es centren més a l'estudi de l'estat de metilació de seqüències específiques del DNA. Concretament, l'optimització dels mètodes basats en el tractament del DNA amb bisulfit sòdic (Clark et al. 1994) permet l'anàlisi d'un nombre limitat de CpGs basant-se en el seu estat de metilació (p.ex. PCR específica de metilació, MSP) així com la caracterització de patrons específics de metilació (seqüenciació de DNA modificat amb bisulfit sòdic).
El bisulfit sòdic convertix les citosines no metilades en uracils mentres les metilades romanen com a tals (Furuichi et al. 1970) (figura). Aquesta reacció permet diferenciar DNA metilat del no metilat. La modificació del DNA produïda pel tractament amb bisulfit sòdic pot ser estudiada mitjançant l'us de diversos mètodes entre els que s'inclouen seqüenciació, MSP, assajos de restricció, etc.

La PCR específica de metilació (MSP) és la tècnica més utilitzada per a estudiar la metilació d'illes CpG, que són molt comuns en els promotors de molts gens. Les citosines de les illes CpG es troben normalment desmetilades en teixits normals però es metilen en promotors de gens implicats en processos cel·lulars anormals com el càncer (Esteller et al. 2001). La PCR específica de metilació (Herman et al. 1996) és una de les técniques més eficients per a estudiar els perfils de metilació d'aquestes regions. Les diferències obtingudes entre els al.lels metilats i desmetilats al tractar amb bisulfit sòdic són la base de la PCR específica de metilació i són especialment útils per a l'estudi d'illes CpG per l'abundància de llocs CpG que contenen.
El disseny de primers és un dels passos més complexos i crítics de la MSP. Les cadenes de DNA modificades amb bisulfit deixen de ser complementàries pel que es deuen dissenyar primers específics per a cada una. La gran sensibilitat d'aquesta tècnica permet determinar l'estat de metilació de mostres menudes de DNA, incloent mostres de teixits embeguts en parafina o microdiseccionats (Herman et al.1996). No obstant, determinar la metilació al nivell de nucleòtid requereix de la seqüenciació dels productes de PCR, l'obtenció de dades quantitatives i la identificació d'heterogeneïtat cel·lular en poblacions encara no és possible amb aquesta tècnica.
La versatilitat de la PCR específica de metilació permet que siga utilitzada com una eina clínica ràpida per a l'avaluació inicial en gran quantitat de pacients amb malalties específiques dependents d'al.lel. Per exemple, la PCR específica de metilació és utilitzada en l'actualitat per a avaluar l'estat de metilació de l'illa CpG del gen SNRPN i per tant per a realitzar un diagnòstic ràpid de les síndromes de Prader-Willi i Angelman (Kosaki et al. 1997).

Referències:
Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M.
High sensitivity mapping of methylated cytosines.
Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.

Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG.
A gene hypermethylation profile of human cancer.
Cancer Res. 2001 Apr 15;61(8):3225-9.

Furuichi Y, Wataya Y, Hayatsu H, Ukita T.
Chemical modification of tRNA-Tyr-yeast with bisulfite. A new method to modify isopentenyladenosine residue.
Biochem Biophys Res Commun. 1970 Dec 9;41(5):1185-91.

Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB.
Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6.

Kosaki K, McGinniss MJ, Veraksa AN, McGinnis WJ, Jones KL.
Prader-Willi and Angelman syndromes: diagnosis with a bisulfite-treated methylation-specific PCR method.
Am J Med Genet. 1997 Dec 19;73(3):308-13.

Electroforesi Capil.lar d'Alta Resolució (HPCE)

Metilació Global de DNA

La metilació global de DNA és considerada un marcador molecular de diversos processos biològics com el càncer (Esteller et al. 2001, Piyathilake et al.2001) i el desenvolupament ontogènic tant en plantes (Fraga et al. 2000a) com a animals (Jones i Wolffe, 1999). En l'actualitat, la concentració de metil-citosines en DNA genòmic es quantifica mitjançant separacions d'alta resolució (HPCE i HPLC) o mitjançant l'ús d'estratègies enzimàtiques i químiques.
El desenvolupament de tècniques d'Electroforesi Capil·lar (CE) presenta avantatges sobre els mètodes utilitzats fins eixe moment per a quantificar el grau de metilació del DNA. Des que es va desenvolupar la CE s'ha comprovat que té una gran capacitat per a separar diversos components del DNA, incloent tota una sèrie d'aductes de les bases (Norwood et al. 1993), Fraga et al. (Fraga et al. 2000b) va publicar la quantificació relativa de metil-citosines en el DNA genòmic de plantes utilitzant un sistema d'Electroforesi Capil·lar d'Alta Resolució (HPCE) per a analitzar DNA genòmic hidrolitzat amb àcid. En aquest context, la separació i quantificació de citosina i metil-citosina només és possible amb l'ús d'un sistema micel.lar de SDS.

En el nostre laboratori s'utilitza una nova estratègia per a determinar la quantitat relativa de metilació del DNA genòmic mitjançant la quantificació de 2'-desoxi-nucleòsids. La detecció i quantificació de 5-metil 2'-desoxi-citidina en DNA genòmic es realitza utilitzant una electroforesi capil.lar micel.lar d'alta resolució (HPCE) i UV-vis com a detector. S'ha vist que aquesta estratègia és més sensible i específica que altres mètodes d'HPCE per a determinar la quantitat de metilació en el DNA, a més de ser més ràpida i barata que altres mètodes basats en l'HPLC. La hidròlisi enzimàtica de nucleòsids millora considerablement la seua detecció i quantificació i permet l'ús d'aquesta tècnica en l'anàlisi de mostres de DNA brutes o poc concentrades com solen ser les obtingudes a partir de les regions meristemàtiques de plantes o teixits embeguts en parafina (Fraga et al. 2002). L'alliberament químic de bases del DNA implica la producció d'una mescla complexa de molècules que complica la detecció i quantificació de metil-citosina quan el DNA no està prou purificat i/o concentrat. Aquest problema es pot solucionar hidrolitzant el DNA amb Nucleasa P1 i fosfatasa alcalina per a produir 2'-desoximononucleòsids, que són separats amb una modificació del mètode d'HPCE descrit prèviament. No obstant, a causa del petit volum de mostra que s'injecta, les anàlisis preparatives amb HPCE no són possibles.

Interaccions DNA-Proteïna

Les interaccions DNA–proteïna són un factor crític en una gran varietat d'estudis biològics, especialment en aquells relacionats amb l'estructura de la cromatina i la regulació de la funció gènica. Hi ha diverses tècniques utilitzades habitualment per a l'estudi d'interaccions DNA–proteïna entre les que cal destacar els assajos de variació de mobilitat electroforètica (EMSA) (Ceglarek i Revzin, 1989). Encara que la tècnica de EMSA s'haja mostrat molt útil en diferents estudis d'interacció DNA proteïna, el seu ús no serveix per a l'anàlisi quantitativa d'aquestes interaccions i l'obtenció de constants d'afinitat per aquest mètode és una tasca molt tediosa. Per contra, el càlcul de les afinitats DNA-proteïna es pot fer de manera precisa mitjançant l'ús de tècniques calorimètriques (Nakatani et al. 2001) però l'equip necessari no es troba habitualment en laboratoris de bioquímica i biologia molecular. No obstant, l'ús de l'Electroforesi Capil·lar d'Alta resolució (HPCE) permet desenvolupar mètodes precisos i reproduïbles per a quantificar l'afinitat DNA-proteïna basats en la seua capacitat per a separar complexos macromoleculars de les subunitats amb les que interaccionen amb gran resolució. De fet, s'han realitzat nombrosos estudis d'interaccions lligand-DNA per HPCE amb capil·lars de sílice fosa no tractats (Tanaka i Terabe, 2002), però generalment les proteïnes d'unió a DNA són riques en aminoàcids bàsics i açò provoca la seua adsorció a la superfície dels capil·lars. Així, l'adsorció de proteïnes amb grups carregats a les parets del capil·lar que conté càrregues negatives és el major contratemps dels mètodes descrits prèviament.
Per a l'estudi quantitatiu d'interaccions DNA-proteïna s'ha desenvolupat un ràpid i simple assaig de variació en la mobilitat electroforètica capil·lar (CEMSA) amb fluorescència induïda per làser (LIF) (Fraga et al. 2003). Este mètode és útil sobretot per a l'estudi de proteïnes bàsiques, les més comunes de les proteïnes que interaccionen amb el DNA. Per a evitar que les proteïnes s'adherisquen a les parets del capil·lar, en el laboratori usem poliacrilamida neutra, que requereix de l'ús de polaritat reversa. En aquestes condicions s'obté una separació excel·lent entre el DNA i els complexos DNA-proteïna sense necessitat d'una matriu, la qual cosa permet al seu torn una senzilla i eficaç quantificació de les afinitats DNA-proteïna.

Quantificació de modificacions postraduccionals d'Histones

L'acetilació de les histones és conseqüència de l'efecte contraposat entre les activitats Histona Acetiltransferasa (HAT) i Histona Desacetilasa (HDAC) i són aquestes modificacions, junt a altres canvis en la cromatina, el que permet les transicions dinàmiques d'estructura de la cromatina i el canvi d'estats d'activitat transcripcional (Jenuwein i Allis, 2001). Per una altra banda, la metilació de les cues N-terminals de les histones H3 i H4 sembla ser un procés més estàtic a diferència de l'acetilació que és un proces molt dinàmic. Així, la metilació i és vist com una marca epigenètica més que com un senyal regulador (Jenuwein, 2001). La metilació d'histones s'ha relacionat sobretot amb la repressió transcripcional a llarg termini de l'heterocromatina, però en contrast amb l'efecte que te l'acetilació global, l'efecte que té la metilació de les histones sobre la transcripció depén del residu modificat i del seu grau de metilació (Lachner i Jenuwein, 2002).
La quantificació dels graus d'acetilació de les histones H3 i H4 es pot realitzar mitjançant una modificació del mètode descrit per Lindner et al. (Lindner et al. 1992), on les formes no acetilades, mono-, di-, tri- i tetra-acetilades de les fraccions corresponents a la histona H3 i a la histona H4 es poden resoldre mitjançant una electroforesi capil.lar d'alta resolució (HPCE). En concret, amb un capil·lar de sílica fosa no recobert i utilitzant com a tampó de separació una dissolució de fosfat amb hidroxi-propil-metil-cel.lulosa (HPM-cel.lulosa) per eliminar les interaccions de les proteïnes extremadament bàsiques amb la paret del capil.lar.
Amb aquesta tècnica també es possible resoldre la metilació associada amb cada espècie acetilada per a la histona H4, pel que s'obté un desdoblament dels pics corresponent amb cada grau d'acetilació com es pot observar a la figura.

Referències:
Ceglarek JA, Revzin A.
Studies of DNA-protein interactions by gel electrophoresis.
Electrophoresis. 1989 May-Jun;10(5-6):360-5.

Esteller M, Fraga MF, Guo M, Garcia-Foncillas J, Hedenfalk I, Godwin AK, Trojan J, Vaurs-Barriere C, Bignon YJ, Ramus S, Benitez J, Caldes T, Akiyama Y, Yuasa Y, Launonen V, Canal MJ, Rodriguez R, Capella G, Peinado MA, Borg A, Aaltonen LA, Ponder BA, Baylin SB, Herman JG.
DNA methylation patterns in hereditary human cancers mimic sporadic tumorigenesis.
Hum Mol Genet. 2001 Dec 15;10(26):3001-7.

Fraga MF, Centeno ML, Valdes AE, Moncalean P, Canal MJ, Rodriguez R.
Genomic DNA methylation and polyamines levels as key processes in plant aging: applications for clonal multiplication of mature Pinus radiata trees, p. 495-506. In E. Ritter and S. Espinel (Eds.), Applications of Biotechnology to Forest Genetics. A.F. Albundia, Vitoria. 2000. (a)

Fraga MF, Rodriguez R, Canal MJ.
Rapid quantification of DNA methylation by high performance capillary electrophoresis.
Electrophoresis. 2000 Aug;21(14):2990-4. (b)

Fraga MF, Uriol E, Borja Diego L, Berdasco M, Esteller M, Canal MJ, Rodriguez R.
High-performance capillary electrophoretic method for the quantification of 5-methyl 2'-deoxycytidine in genomic DNA: application to plant, animal and human cancer tissues.
Electrophoresis. 2002 Jun;23(11):1677-81.

Fraga MF, Ballestar E, Esteller M.
Capillary electrophoresis-based method to quantitate DNA-protein interactions.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003 Jun 15;789(2):431-5.

Jenuwein T.
Re-SET-ting heterochromatin by histone methyltransferases.
Trends Cell Biol. 2001 Jun;11(6):266-73.

Jenuwein T, Allis CD.
Translating the histone code.
Science. 2001 Aug 10;293(5532):1074-80.

Jones PL, Wolffe AP.
Relationships between chromatin organization and DNA methylation in determining gene expression.
Semin Cancer Biol. 1999 Oct;9(5):339-47.

Lachner M, Jenuwein T.
The many faces of histone lysine methylation.
Curr Opin Cell Biol. 2002 Jun;14(3):286-98.

Lindner H, Helliger W, Dirschlmayer A, Jaquemar M, Puschendorf B.
High-performance capillary electrophoresis of core histones and their acetylated modified derivatives. Biochem J. 1992 283 (Pt 2) 467-71.

Nakatani K, Sando S, Kumasawa H, Kikuchi J, Saito I.
Recognition of guanine-guanine mismatches by the dimeric form of 2-amino-1,8-naphthyridine.
J Am Chem Soc. 2001 Dec 19;123(50):12650-7.

Norwood CB, Jackim E, Cheer S.
DNA adduct research with capillary electrophoresis.
Anal Biochem. 1993 Sep;213(2):194-9.

Piyathilake CJ, Frost AR, Bell WC, Oelschlager D, Weiss H, Johanning GL, Niveleau A, Heimburger DC, Grizzle WE.
Altered global methylation of DNA: an epigenetic difference in susceptibility for lung cancer is associated with its progression.
Hum Pathol. 2001 Aug;32(8):856-62.

Tanaka Y, Terabe S.
Estimation of binding constants by capillary electrophoresis.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002 Feb 25;768(1):81-92.

AIMS

Próximament!!

RLGS

Próximament!!